作者：湯姆貓

前言

圖一 部分針對HCV的藥物

丙肝是一種由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要經血液傳播，如不潔針頭、輸血、穿刺等，僅在美國就有400萬感染群體，在中國約有1000萬患者，而在全世界患有丙肝的人數大約有1.8億人之多。丙肝潛伏期長，早期癥狀不明顯，如果不及時控制感染情況，會引起肝細胞的纖維化，并逐步導致肝硬化，進而發展成為肝癌。對于丙肝的治療，早期主要以干擾素和利巴韋林配合用藥，但副作用較大，后來陸續不斷有新的化合物問世，如特拉匹韋（Telaprevir）、索非布韋（Sofosbuvir）等，而處于臨床研究階段的有Radalbuvir等。由于HCV的基因型有六種之多，亞基因型就更多了。另外，長時間服用單一的抗病毒藥物容易引起耐藥性，因此和HCV的斗爭將是長期的。

圖二 Beclabuvir結構式

Beclabuvir（BMS-791325）是Bristol-Myers Squibb開發的一種非核苷類NS5B RNA聚合酶抑制劑，目前還處于臨床研究階段（Phase III）。與其他含環丙烷結構藥物不同的是，Beclabuvir的并環手性環丙烷結構對工藝放大提出了較高的要求。由于環丙烷結構具有較大的環張力，因此在藥物結構中能夠對分子的構象自由度產生較大的影響，在進行先導物優化時，嵌入環丙烷結構可能會取得意想不到的效果，本文分別以“藥物化學路線”和“工藝放大路線”介紹此Beclabuvir的制備方法，以供參考。

藥物化學路線

圖三 中間體7的制備

援引Boehringer-Ingelheim類似化合物的專利，以6-吲哚甲酸為起始原料，在堿性條件下，吲哚3位與環己酮發生親核加成-消除反應，然后在50 psi的氫壓下還原共軛雙鍵、甲酯化，得到6-吲哚甲酸酯類化合物3，將3溴化后水解，以5步操作，56%的總收率得到羧酸4，BMS早期的專利以化合物4為起始原料，與N,N-二甲基磺酰胺縮合后再與硼酸6偶聯，得到醛7。

圖四 Beclabuvir的合成

在得到醛7后，將其與磷酸酯8在CsCO3作用下發生Michael addition-HWE烯化串聯反應（其具體歷程如圖四所示），得到不飽和酯9，9在經典的Corey-Chaykovsky條件下反應得到消旋環丙烷化產物10，將10手性拆分，得到的光學純產物11后，水解成酸與12縮合，得到目標產物13。

上述的藥物化學路線呈線性策略，以中間體4計，共需7步，總收率約14%，基本能夠滿足早期的活性測試、毒理、動物試驗，但由于磷酸酯8不穩定，容易發生聚合反應，且手性拆分在整個路線的后續階段，造成較大的浪費，因此，為滿足后續開展的臨床試驗，需要一條更加可靠而且能夠放大的路線。

工藝路線

圖五 合成分析

依據匯聚式的合成策略，將化合物13拆解為三個單一模塊：14、12、15，首先14與15經N-烷基化反應組合，然后分子內偶聯反應得到八元并環體系，最后與12縮合得到目標產物13，此設計的優勢在于：第一、單獨制備手性環丙烷模塊15，避免了在路線后階段手性拆分的巨大浪費（理論上只有50%的收率）；第二，將12的組裝放在了路線的最后階段，因為化合物12價格高昂，試劑級別的可以賣到5000 ¥/g；第三，單個模塊制備的優化，不會影響整條工藝路線，尤其是中間體15。整個設計中，難度較大的在于手性環丙烷模塊的制備，BMS的工藝化學家采用了不對稱的金屬催化卡賓環丙烷化反應。

中間體14的制備

圖六 中間體14的制備及雜質

藥物化學路線中，化合物3的制備需要三步反應，而且還要用到貴金屬催化劑，采用還原烷基化反應后，大大提高了反應的效率，以兩步72%的收率得到中間體3，在放大到100kg級別時，收率和產物質量仍能保持，兩步操作均只需要簡單的后處理即可達到理想純度。值得注意的是，NaOH水解時，堿的濃度過大會導致酯交換產物的出現。將3與N,N-二甲基磺酰胺在先前的縮合條件下反應時，發現生成了較多的雜質18，由于沒有溴取代的存在，吲哚氮的親核性較強，與磺酰胺競爭性的進攻酰基咪唑活性中間體，產生雜質18。

圖七 中間體14的工藝改進

在嘗試更換溶劑以及調整加料順序，仍不能改善反應狀況后，用Boc將吲哚暫時保護，以DBU做堿，完成磺酰胺的制備后，再脫除保護基。通常情況下，Boc保護采用酸性條件脫除，但是在該路線中，由于未反應的CDI在酸性條件下快速分解，釋放出大量的CO2氣體，容易引發安全事故，因此將中間體4c在堿性條件下加熱，在脫除Boc保護的同時，過量的CDI發生緩慢可控的分解，待反應完全后，加入鹽酸中和，可以76%的收率得到目標產物14。重復四個批次，總計得到254 Kg的產物，產品質量和收率均能保持穩定。

手性環丙烷15的制備

圖八 手性拆分制備模塊15

手性環丙烷模塊15可以簡化為前體化合物19，令人驚喜的是，化合物19表現出良好的結晶性，而且與（R）-1-苯乙胺（（R）-AMBA）形成的鹽20也能很好的結晶，這一性質不僅可以用于手性拆分制備模塊15，也可以在不對稱合成中提高產物的ee值。在得到鹽20后，將其溶解在乙醇中，利用TMSCl原位生成HCl，很順利的發生酯化反應。在進行羥基的甲苯磺酰化時，優選DABCO，其不僅能起到堿的作用，同時也能催化該反應的進行，一般在進行磺酰化反應時，常用吡啶做堿或溶劑，其他有機堿則經常會遇到反應不完或反應很慢的現象，考慮到吡啶的揮發性以及毒性，采用DABCO是很好的一個選擇。至此，關鍵的步驟就在于手性化合物19的制備。

圖九 不對稱環丙烷化路線設計

1996年，Huw M. L.Davies在JACS上報道過一例關于不對稱的金屬催化環丙烷化反應，重氮化物在手性銠金屬配合物的催化下，與烯烴發生不對稱卡賓插入，得到手性環丙烷產物。受此啟發，烯烴22與23經此法反應得到化合物21，然后將雙鍵切斷成醛，再還原可得到目標化合物19a。眾所周知，重氮化物的穩定性欠佳，在工藝過程中操作起來較為復雜，如何放大該過程則成為關鍵問題。

圖十 關鍵環丙烷化反應

將3-甲氧基苯甲醛在醋酸中溴化，然后過濾，所得濾餅用碳酸鈉溶液多次洗滌，除去多余的醋酸，以85%的收率得到溴化產物25。經Wittig反應得到關鍵前體22，此步反應的后處理非常重要，因為殘留的三苯基膦會嚴重的影響下一步不對稱環丙烷化反應，即使是400 ppm的殘留也會造成催化效率的降低，因此，當反應完全后，加入過碳酸鈉和H2O2水溶液，將殘余的三苯基膦氧化為三苯氧磷，然后將產物溶于正庚烷中，三苯氧磷結晶析出，并用堿性氧化鋁過濾，蒸發掉部分溶劑后，可得到約25%質量濃度的化合物22正庚烷溶液。放大至公斤級別時，收率在55%-65%左右。

重氮化物23的制備以26為原料，在乙腈中與4-ABSA反應，可以77%的收率得到重氮化物，水相后處理可清除掉DBU，同時4-ABSA產生的磺胺類物質結晶析出，通過簡單的過濾即可除去，值得注意的是，乙腈的溶劑殘留會影響到下一步催化劑的效率，需控制在0.5%以內。在進行關鍵的環丙烷化反應之前，對重氮化物的安全性和穩定性需要有充分的認識，因為此類化合物易分解產生N2，容易造成安全事故，但與其他重氮化物不同的是，23雖容易變質，但不會放出氮氣，而是經電環化反應生成吡唑類產物27，在固體狀態下，其起始變質溫度為42 ℃，在溶液中，其穩定性和溶劑以及濃度密切相關，通過量熱法分析可知，在小于10%質量濃度的正庚烷溶液中，其變質速率在3−5%之間，但電環化產物27不溶于正庚烷，在使用之前過濾即可保證重氮化物23的純度。

得到烯烴22和重氮化物23后（兩者均為正庚烷溶液），以23為基準，在反應釜中加入1.1當量的22，然后室溫下加入0.2 mol %的Rh2(S-DOSP)4，控制23在1 h內加完（過快加入會產生大量N2，易造成沖料事故），收率能夠達到90%，該反應放大時產物ee值介于80.6%到83.2%之間，至此，完成了關鍵的不對稱環丙烷化反應。

最終的模塊組裝

圖十一 吲哚烷基化

在完成關鍵的環丙烷化反應后，將反應液的溶劑置換為DCM，經過雙鍵的臭氧化、臭氧化物還原等一系列的官能團轉化后，得到羧酸鋰化合物21a，用MTBE萃取堿性水相溶液，即可除去過量22以及21氧化還原過程所產生的雜質，再將水相用HCl調回酸性后，萃取即可得到純化的環丙烷化產物，將化合物20用（R）-1-苯乙胺進行結晶，可將ee值由80%左右提高到99%以上，然后參照先前手性拆分時優化的路線（圖八）順利得到模塊15。

在進行吲哚氮的烷基化時，首先采用15的結晶體，但是差示掃描量熱法分析顯示15容易發生自催化的環丙烷開環反應，將15制備成4 L/kg的甲苯溶液，能夠較好的避免這一現象。在烷基化反應時，發現堿的用量非常重要，即使稍過量的堿，也會造成環丙烷部分的差向異構化（28a），此外，少量的28a也會影響到產物的結晶，多次優化表明，吲哚模塊宜稍微過量（1.1 equiv），堿的用量宜控制在1.9~1.95當量之間，在具體操作時，吲哚模塊和堿宜首先加90%的用量，然后根據反應進行的情況補加額外的堿和吲哚14，可保證15反應完全，在300 g規模的小試中，能以99%的HPLC純度和74%的收率能得到產物28。由于此操作較為復雜，放大至公斤級時，略去了補加這一操作，容忍部分15未反應以保障產物的質量以及結晶性。在中試時，該反應的重復性較差，分三個批次制備了181 Kg的28，產率分別為39%、51%以及61%，純度能保持在92%以上，因此吲哚模塊的烷基化部分，還需要進一步的優化才能達到商業化的要求。

圖十二 鈀催化吲哚芳基化模型研究

在進行28的吲哚芳基化反應時，先采用化合物29進行模型研究。在進行初步篩選后，以NMP為溶劑，掉溴產物30a較多，DMF和DMAc相對較好，此外，溶劑中水含量過高也會引起掉溴產物的增多。催化劑篩選顯示Pd(dba)2 和 Pd(tfa)2也會產生較多的30a，而Pd(OAc)2效果較佳，僅5mol %的用量就能保證底物完全轉化。對配體的篩選發現PCy3HBF4效果最佳，而卡賓類配體則會產生大量的化合物30b。小量反應時采用K2CO3做堿，在放大時發現了掉溴產物的出現，換用KOAc后則很好的避免了這一問題。經過模型研究后，探索出的最佳條件為：5 mol %的Pd(OAc)2，10 mol %的PCy3·HBF4，5當量的KOAc，反應完全后，除目標產物外，有部分酯基水解產物30c出現，但這并不影響，因為下一步就是酯水解。

圖十三 鈀催化吲哚芳基化工藝及優化

值得高興的是，模型研究的最優條件能夠很好的移植到底物28的分子內偶聯反應中。將甲酯置換為乙酯后，水解穩定性得到提高，待反應完全后，將DMAc蒸發，加入檸檬酸溶液，MTBE萃取后加入KOH水溶液劇烈攪拌，水解完全后首先用MTBE萃取除去磷配體，然后檸檬酸中和后將產物用MTBE萃取出來，將溶劑置換為乙醇，加入KOEt溶液后，產物以鉀鹽合一分子乙醇的形式析出，結合的乙醇需要在超過50 oC的溫度下才能除去但這會導致產物變色，因此不適宜。重復該過程得到9.14 Kg的目標產物，平均收率68.2%，主要雜質為掉溴產物28b，鈀殘留也較高（~110 ppm）。

上述路線還存在諸多缺陷，首先反應時間較長，需要12-16 h；其次，高沸點的DMAc不便于后期的處理；再次，鈀殘留過高；最后操作冗長，不夠簡練。首先對關鍵的鈀催化分子內偶聯反應的堿進行了大量篩選，最后發現采用KHCO3能夠大幅縮短反應時間，只需要4 h就能反應完全；將溶劑置換為DMAc/PhMe = 1:1的混合溶劑，偶聯反應完全后，直接將水和固體的KOH加至冷卻的反應液中，略去了檸檬酸中和的操作。待酯水解完全后過濾除去鈀催化劑，同時未水解的雜質28a溶解在甲苯中也被帶走，然后將水相用鹽酸中和，MTBE萃取，大量的DMAc溶于水相被除去，避免了DMAc的蒸發操作；將MTBE置換為乙醇，在加入KOEt結晶之前，加入少量的DMAc能夠促進結晶，與先前的操作相比，僅需一次結晶過程就能完成產物的全部析出，最終產物以鉀鹽合1/2DMAc的形式析出，同時也避免了殘留乙醇的處理過程，收率也得到了提高，達到85%，鈀殘留小于100 ppm，操作流程也得以簡化。

圖十四 BMS-791325鹽酸鹽的合成

在進行最終的酰胺化時，采用先前藥物化學路線中的TBTU作為縮合試劑，但是產生較多的雜質，且反應液顏色很重，純化操作復雜，而EDAC體系則表現非常好，在對反應溶劑的篩選中發現MeCN、DMF、THF均適用于此縮合反應，但MeCN是最為合適的選擇，因為MeCN與31•K共沸蒸餾可有效去除原料中殘留的乙醇以及水分。經優化后的操作流程如下：底物共沸蒸餾、加入12，然后在依次加入HOBt、EDAC、DIPEA，未觀察到可能的雜質32a和32b的出現。由于產物BMS-791325具有一定的水溶性，而EDAC的副產物以及HOBt、DIPEA也均溶于水，后處理時稍有不慎就可能造成產物的大量損失，因此在萃取處理時，用醋酸將水相酸堿性調至終產物的等電點范圍內（pH ∼4.5−7.0，等電點是一個分子或者表面不帶電荷時的pH值），能夠有效的避免產物的損失。

經上述處理后，有機相中仍然含有大量HOBt，通常HOBt可采用堿性水溶液除去，但如果采用此法，API損失較為嚴重，將傳統的堿性水溶液調整為pH = 7的K2HPO4/KH2PO4緩沖溶液，將萃取溶劑由EtOAc調整為iPrOAc，可有效的除去HOBt，處理完后，將所得的有機相（MeCN/iPrOAc）用iPrOAc恒容蒸餾，MeCN殘留可降至檢測限以下，然后再次用EtOH恒容蒸餾，將iPrOAc置換為EtOH，最后加入鹽酸乙醇和MTBE結晶，得到目標產物的鹽酸鹽結晶，經過上述工藝，分三個批次制備了68.9 Kg的BMS-791325鹽酸鹽，平均收率78.5%，HPLC純度大于99.6%，且ee值在99%以上。此工藝的缺點在于，大約有16%的產物殘留在母液中無法析出，因此還需要后續的優化。

備注：恒容蒸發是工藝中常見的溶劑置換操作，將含有產物的有機相蒸發至產物即將析出的臨界點，然后持續加入置換溶劑，保證加入量和蒸發量相等，即保持產物溶液的體積不變，此操作能夠有效的除去限制溶劑的殘余。

總結

本文簡要介紹了Beclabuvir（BMS-791325）從藥物化學路線到工藝生產路線的開發歷程。工藝路線采用了高效的匯聚式合成策略，吲哚模塊14經六步操作三次純化，總收率達到53%。模塊20的（R）-1-苯乙胺鹽的制備經不對稱環丙烷化反應及連續的官能團轉化得到（七步反應，兩次分離純化），總收率26%。最后的組合（模塊14、20以及12）經六步反應三次分離純化，總收率32%，整個工藝路線最長線性步驟12步，以8.2%的最終總收率得到目標產物BMS-791325•HCl。

利用重氮化物進行卡賓插入反應，是天然產物合成中非常高效的操作，但是由于其安全性以及穩定性的問題，限制了此類中間體在工業領域的應用。此工藝路線是Davis不對稱環丙烷化的首次工業應用，其對重氮化物的操作非常值得借鑒！在整個工藝開發中，對化合物的安全性以及穩定性的仔細研究，如重氮化物23以及環丙烷產物15，是安全生產和工藝順利開發的保障，最后對于后處理的細致研究，如緩沖溶液洗滌、恒容蒸餾等，也非常值得學習借鑒。

參考資料：

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