根據世界衛生組織的數據，全世界有4.66億人患殘疾性聽力損失，相當于平均不到20人中就有1人喪失聽力。遺傳造成的聽力損失還是新生兒最常見的殘疾之一。基因編輯技術的問世，為治療基因缺陷引起的遺傳性耳聾帶來了前所未有的希望。

最近，哈佛醫學院和波士頓兒童醫院的一支聯合研究團隊，利用優化的CRISPR-Cas9基因編輯系統，在耳聾小鼠模型上精確識別并修正內耳的致聾突變，幫助小鼠留住聽力。這一概念驗證的完成有望為眾多遺傳性耳聾患者帶來安全的基因編輯療法。研究成果日前發表在學術期刊《自然-醫學》。

貝多芬小鼠

在我們的耳朵深處，也就是被稱為內耳的部分，有一類“毛細胞”，它們分布在內耳表面，形狀如一叢叢鬃毛，在聽覺中發揮重要作用。

耳鼻喉科教授Jeffrey Holt和轉化醫學科學教授David Corey領導的研究小組過去發現，毛細胞要行使傳導聽覺信號的功能，離不開一種叫作TMC1的蛋白。當編碼TMC1蛋白的基因發生突變，毛細胞會逐漸退化和死亡，導致聽力喪失。某些遺傳性耳聾患者在10~15歲開始逐漸失聰、到25歲左右完全喪失聽力，正是因為TMC1基因突變。

▲David Corey教授（左）和Jeffrey Holt教授（右）（圖片來源： Michael Goderre，波士頓兒童醫院）

科學家發現TMC1基因后，利用同樣的突變構建了一種疾病模型小鼠，希望在此基礎上研究疾病的治療方法。這些基因突變小鼠會在出生一段時間后逐漸損失聽力，到“青壯年”時完全失聰。科學家們給這種疾病模型起名為“貝多芬小鼠”，因為它們表現出的病程正與大音樂家貝多芬經歷的進行性聽力喪失相似。不過，順便一提，貝多芬失聰的真正原因仍沒有定論。

精確找到30億分之一

和TMC1突變的耳聾患者一樣，貝多芬小鼠體內的Tmc1基因僅僅出現了“一點”小錯誤：在來自父母雙方的兩個基因拷貝中，一個Tmc1出現突變就會致聾；而突變的DNA序列，僅僅是一個堿基發生了變化。

想要通過基因療法修正DNA錯誤，用研究者的話說，意味著他們的基因編輯系統需要成功地在小鼠基因組的30億個堿基字母中找出一個錯誤的字母。

為了精確定位貝多芬小鼠的錯誤基因拷貝，同時不影響正常基因，研究團隊在經典CRISPR-Cas9系統的基礎上進行改良，分別對引導分子gRNA和內切酶Cas9都做了優化。細胞實驗中的初步檢驗表明，優化后的CRISPR-Cas9工具能在Tmc1基因的兩個拷貝中準確區分突變版本和正常版本。

隨后，研究人員通過腺相關病毒（AAV）載體將基因療法遞送到小鼠內耳。

▲在貝多芬小鼠出生后進行基因編輯治療，并在此后數十周內評估療法對疾病發展的影響（圖片來源：參考資料[1]）

DNA分析的結果顯示，基因編輯活性只局限于在貝多芬小鼠的內耳細胞。而對正常小鼠做同樣的“治療”，沒有在內耳細胞中檢測到任何編輯變化，說明這種療法沒有干擾正常的基因功能，進一步說明了該工具的特異性。

研究人員在顯微鏡下觀察了小鼠內耳的毛細胞。不出所料，在未經治療的貝多芬小鼠中，毛細胞隨著結構的惡化逐漸消失；相比之下，接受治療后的小鼠，保留了正常數量的毛細胞，結構完整或近乎完整。

▲正常毛細胞，貝多芬小鼠未經治療時的毛細胞，經過治療的毛細胞（圖片來源: Carl Nist-Lund and Jeffrey Holt）

內耳毛細胞的結構得到挽救后確實能起到改善聽力的作用嗎？科學家們通過“聽性腦干反應（ABR）”檢查了小鼠的聽力。這種測試方法檢查不同強度聲音刺激下的腦電波反應，意味著內耳中聽覺細胞捕獲到聲音后把信號傳到了大腦。這也是新生兒聽力篩查的常用方法。

在不治療的情況下，貝多芬小鼠通常在1個月大時就開始對高頻聲音反應降低，6個月大時完全失聰。相比之下，出生后不久就接受基因編輯療法的小鼠，在2個月時與健康小鼠的聽力幾乎沒有差別；到6個月大時，對低頻聲音的聽力仍保持正常，有些甚至對高頻聲音的反應也接近健康小鼠。更令人鼓舞的是，有一部分經過治療的貝多芬小鼠，在此后的近一年里保持了穩定的聽力！

▲經過治療的貝多芬小鼠幾乎可以和正常小鼠一樣聽到低至30分貝左右的聲音，相當于我們低聲耳語的響度（圖片來源：參考資料[1]）

在人們非常關注的安全性上，這種療法的表現也值得一提。科學家們給沒有攜帶缺陷基因的小鼠施用療法后，小鼠沒有因此遭受任何聽力損失。

在這項研究的最后，為測試該療法在遺傳性失聰患者上的治療潛力，科學家們在一系列攜帶TMC1突變的人類細胞系上進行了實驗。DNA分析顯示，只有突變拷貝會被編輯，同一個細胞中的正常拷貝不會受影響。

▲經過優化的CRISPR-Cas9特異性靶向人類TMC1突變細胞中的單個堿基突變（圖片來源：參考資料[1]）

從這些結果來看，研究團隊帶來的新CRISPR-Cas9工具“大大提高了標準基因編輯技術的有效性和安全性”。但他們也提醒，即便是像這樣已經高度精確的基因編輯療法，在用于人類之前仍有大量工作需要做。

由于這種方法能夠靶向單個點突變，受益的將不僅僅是TMC1突變造成的遺傳性耳聾患者，由其他聽覺基因單突變造成的15種遺傳性耳聾也都有望通過這種方法得到治療。這樣的進展無疑令人期待！“我們相信，這些結果打開了一扇大門，由基因單拷貝缺陷造成的一系列遺傳疾病都可以在此基礎上開發靶向治療。”Holt教授說，“這真的是精準治療。”

貝多芬本人沒有親耳聽過《歡樂頌》，而精準的基因編輯療法正在接近治愈疾病的目標，為眾多耳聾患者帶來一曲歡樂頌。

參考資料

[1] Bence Gyorgy et al., (2019) Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. DOI: 10.1038/s41591-019-0500-9

[2] Vreugde, S. et al. (2002) Beethoven, a mouse model for dominant, progressive hearing loss DFNA36. Nature Genetic

[3] Pan, B. et al. (2018) TMC1 forms the pore of mechanosensory transduction channels in vertebrate inner ear hair cells. Neuron.

[4] The Hearing Molecule. Retrieved Jul 4, 2019 from https://hms.harvard.edu/news/saving-beethoven

[5] Deafness and hearing loss. Retrieved Jul 5, 2019, from https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss