近日，一項刊登在國際雜志The New England Journal of Medicine上的研究報告中，來自北京大學-清華大學生命科學聯合中心鄧宏魁研究組、解放軍總醫院第五醫學中心陳虎研究組及首都醫科大學附屬北京佑安醫院吳昊研究組的研究人員通過聯合研究發表了題為“CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia”（利用CRISPR基因編輯的成體造血干細胞在患有艾滋病合并急性淋巴細胞白血病患者中的長期重建）的研究論文，這項研究成果標志著世界上首例通過基因編輯干細胞治療艾滋病和白血病患者的案例由我國科學家成功完成了！

CCR5修飾的HSPCs的移植

圖片來源：Lei Xu et al. N Engl J Med 2019 DOI：10.1056/NEJMoa1817426

我們都知道，如今CRISPR-Cas9基因編輯工具對哺乳動物細胞的基因組進行編輯已經被廣泛使用了，該技術展現出了潛在的臨床使用前途，而且目前研究人員已經開始利用該技術來探尋基于CRISPR的療法治療人類疾病的安全性和可行性。CCR5是HIV-1感染人體的一個保護性靶點，CCR5缺失的血細胞常常對HIV-1的感染有很大的抵抗力；有研究表明，當將攜帶天然CCR5突變的造血干細胞和祖細胞（HSPCs，hematopoietic stem and progenitor cells，造血干祖細胞）進行同種異體移植后（allogeneic transplantation）就能長期根除HIV-1，因為CCR5是HIV進入機體的關鍵共受體，這些事例或許就增加了一種可能性，即移植攜帶人工破壞CCR5的細胞或能作為一種新方法來制造對HIV-1感染耐受的細胞。

此前研究中，研究人員建立了一種無病毒的CRISPR基因編輯系統，其能產生CCR5被破壞的人類HSPCs，效率能達到27%；在動物模型中，這些CCR5修飾的HSPCs能產生一種對HIV-1感染耐受的強大免疫系統；這項研究中，研究人員將CRISPR編輯的CCR5被剔除的造血干祖細胞（HSPCs）移植到HIV-1感染且患有急性淋巴細胞白血病（ALL）的患者中，研究者發現，患者的ALL能夠得到完全緩解（完全供體嵌合），而且攜帶CCR5被剔除的供體細胞能在患者體內存活長達19個月以上，同時患者并未出現于基因編輯相關的不良反應。在患者抗逆轉錄病毒治療中斷期間，攜帶CCR5被剔除的CD4+ T細胞的比例略有增加，盡管研究人員實現了CRISPR編輯的HSPCs的成功和長期移植，但淋巴細胞中CCR5被破壞的比例僅有5%左右，這還需要研究人員后期進一步深入研究。

2017年鄧宏魁課題組對該技術體系進行了優化，同時致力于該技術的臨床應用，目前已經通過原解放軍第307醫院倫理委員會審批，在ClinicalTrials.gov網站上進行了臨床研究注冊(NCT03164135)。這項研究中的患者分別在2016年5月14和5月16倍診斷為HIV-AIDS和ALL（T細胞型），患者體內病毒載量為8.5*106拷貝/毫升，CD4+ 細胞計數結果為528*106/升，患者隨機使用抗逆轉錄病毒藥物進行治療，即每天300 mg拉米夫定、300 mg的替諾福韋、每天兩次洛匹那韋-利托那韋（400mg洛匹那韋和100mg利托那韋），治療1年后患者體內的HIV-1感染能得到有效控制，且血清中檢測不到病毒RNA的存在（即小于40拷貝/毫升）；患者同時還接受了6個療程的ALL標準化療，化療使得患者的癥狀得到了完全緩解，通過流式細胞技術進行檢測后，患者在化療第5個第6個療程之前的微小殘留病（minimal residual disease）分別為3.10%和0.04%，6個療程后微小殘留病檢測不到了（小于0.01%）。供體為一名33歲來自中國骨髓捐獻計劃中的男性捐獻者，其攜帶有未突變的CCCR5基因，其與受體具有完全匹配的HLA（組織相容性抗原），2017年9月。患者接受了異體造血干祖細胞移植。

這項研究中，研究人員報道了利用CRISPR-Cas9基因編輯的CCR5突變的HSPCs成功對感染HIV-1合并ALL的患者進行同種異體移植的案例，供體細胞完全嵌合，移植HSPCs后患者的ALL在19個月內能夠保持完全緩解的狀態，在此期間，經過修飾的CCR5基因能夠持續存在，在骨髓細胞中CCR5突變的范圍為5.20%-8.28%，研究結果證明了研究者能夠實現CRISPR編輯的同種異體HSPCs的長期移植，然而移植后受體的反應效率或許還不足以達到治愈HIV-1感染的目標。

在研究者19個月的隨訪觀察中，他們發現，CRISPR介導的CCR5剔除效率在骨髓樣本中為5.20%-8.28%，同時研究者在多個造血譜系細胞中觀察到了CRISPR介導的CCR5剔除的狀況，這就表明CCR5剔除/突變的HSPCs能長期移植到患者機體中并發揮相應的作用。尤其是，患者機體中的CD4+ T細胞和CCR5突變體能夠持續產生并不斷釋放到患者的外周血中，而外周血中的CD4+ T細胞的數量也會在患者移植后6個月內逐漸恢復到正常水平，同時患者接受HIV-1感染的治療還能為其提供機會性的保護。

本文研究的重要一點在于研究者能夠評估CRISPR-Cas9介導的基因療法的臨床安全性，此前基于HSPC的基因療法并沒有那么有效，原因在于外源性DNA會隨機整合到宿主基因組中，有時候甚至會引發急性免疫反應或腫瘤的發生。這項研究中，研究者通過非病毒轉染的方式來引入Cas9核糖核蛋白，從而就能有效避免外源性DNA的引入及Cas9在靶細胞中的長期存在，這或許就是導致意外脫靶突變的潛在因素。利用高通量全基因組測序的方法，研究人員分析了患者移植前的樣品和移植后15周、12個月及19個月的樣品，結果并未檢測到任何單核苷酸的突變、大型片段的缺失及與CRISPR修飾相關的染色體重排等；此外，研究者也并未觀察到與基因編輯相關的負面事件。基因編輯和脫靶效應所帶來的臨床不良事件往往能為基因編輯方法的安全性提供初步支持，然而，目前低效率靶向作用CCR5或許限制了脫靶基因編輯分析的深度；因此，研究人員有必要在更高的基因靶向作用下，進一步分析CRISPR-Cas9介導的HSPCs中CCR5突變的安全性和效率。

在患者移植HSPCs后7個月中斷了抗逆轉錄病毒治療，在中斷兩周后研究者觀察到患者機體中CCR5缺失的比率有所增加；在患者機體基因編輯效率降低可能是因為CD34缺失的細胞中共融合HSPCs的競爭性移植以及供體T細胞的持久性，為了進一步闡明CCR5突變的HSPCs抵御HIV-1的效率，研究人員非常有必要增加CRISPR-Cas9基因編輯系統的效率以及改善移植方案。

最近有研究表明，CCR5-Δ32突變的純合性往往與患者的預期壽命下降有關，這或許就凸顯了CCR5突變在個體水平下的潛在有害效應；然而，與控制HIV感染的其它基因編輯策略不同的是，HIV感染患者機體造血系統中CCR5的剔除/突變并不會改變非造血組織中基因的表達。

總而言之，中國科學家的這項最新研究描述了同種異體干細胞移植后CCR5 CRISPR基因編輯的CD34+細胞的長期移植狀況，其對循環骨髓細胞基因組的基因干擾比率不到8%，而且并不存在基因編輯的脫靶效應。這項長達多年的工作目前已經初步證實了基因編輯造血干細胞在臨床應用中的可行性與安全性，未來將會促進和推動該技術的臨床應用。未來研究人員將會繼續深入研究通過各種方法來優化基因編輯造血干細胞移植方案，從而降低脫靶率，實現100%的CCR5的敲除效率。

參考資料：

Lei Xu， M.D.， Ph.D.， Jun Wang， M.D.， Ph.D.， Yulin Liu， B.S.， et al. CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia， N Engl J Med 2019； 381：1240-1247 doi：10.1056/NEJMoa1817426